大多數用于抗體生產的細胞主要基于動物細胞上的開發，如 MRC-5 人二倍體細胞、 Vero 猿猴腎上皮細胞、Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細胞和雞胚成纖維細胞 。尤其是來自非洲綠猴腎臟的 Vero 細胞已被廣泛用于vaccine生產，因為它們被WHO機構證明沒有致癌潛力。許多vaccine，例如針對基孔肯雅熱、登革熱、日本腦炎、病毒性胃腸炎、脊髓灰質炎、狂犬病、羅斯河熱、嚴重急性呼吸系統綜合癥、天花、西尼羅河腦炎和流感的 vaccine都是使用 Vero 細胞培養系統開發的。
用于virus  vaccine生產的細胞依賴于貼壁，因此涉及這些細胞的過程不能輕易擴大規模，因為需要貼壁空間和胰蛋白酶消化。這導致了具有懸浮生長能力的永生和穩定細胞系的發展.近期研究中，研究人員成功地在微載體上培養了 Vero 細胞，用于制備這些細胞的懸浮培養物。實驗表明，在沒有微載體的情況下培養的懸浮適應性 Vero 細胞比貼壁 Vero 細胞產生更高量的 virus。
Vero 細胞培養使用動物來源的成分較多，如血清、胰蛋白酶、乳清蛋白等。由于成本高和批次間差異，盡量使用血清。此外，牛血清的病毒、細菌和真菌、支原體污染也是細胞培養中的主要污染來源。因此，無血清細胞培養體系的優化對于疫苗株的生產是必要的。  之前的研究中，在無血清 EX-Cell MDCK 中培養的 MDCK 細胞比在含血清的 Glasgow 低必需培養基中培養的細胞產生更多的 virus。此外，還探索了在無血清培養基中培養 Vero 細胞來生產許多virus  vaccine。
在這項研究中，我們試圖促進 Vero 細胞在振蕩懸浮培養系統中的適應性，并確定哪種培養基適合在無血清的情況下培養 Vero 細胞。與傳統的 Vero 細胞貼壁培養相比，Vero 細胞成功地適應了懸浮培養系統并產生了更多的 Adv。
實驗前準備：
Vero 和 FRhk-4 細胞使用 10% 胎牛血清的DMEM培養基，培養基中添加1u/mL的青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素。培養條件為 5% CO₂含量，37℃。
MRC-5 細胞在含有 10% FBS 和 1 U/mL 青霉素和 1 µg/mL 鏈霉素的改良型 Eagle 培養基中。培養條件為 5% CO 2中， 37℃培養。
5 型 Adv (Ad5)  - GFP綠色熒光蛋白 。使用含有 2% FBS 的 DMEM 在 Vero 細胞中進行轉染繁殖。
一、培養基的選擇性實驗
OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是無血清、超低蛋白培養基，不含蛋白質、肽或其他動物或人類來源的成分。
Gibco 的Opt-MEM 減血清培養基是一種改進的 MEM，可以減少 FBS 的添加量。UltraCULTURE 培養基是一種無血清培養基，設計用于培養補充有重組人胰島素、牛轉鐵蛋白和牛血清蛋白（包括白蛋白）的純化混合物的哺乳動物細胞類型。
SFM4MegaVir屬于一種無蛋白培養基，使用這種培養基的目的在于提高不含動物來源成分的virus  vaccine生 產過程的產量。實驗過程中需要 逐步降低 FBS 的百分比值，來適應無血清培養條件。
我們主要在Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM這五種培養基中嘗試了細胞適應。
1.細胞在 5% CO2 下培養2條件37℃。將細胞以1×10 ⁶ 個細胞/培養皿的濃度接種在細胞培養皿中。
2.在 37℃、5% CO 2條件下培養 72 小時后，使用細胞計數儀和 0.4% 臺盼藍染色測定總細胞數，然后用 1×10 ⁶ 個細胞/盤，逐步減少常規培養基的百分比。
3.使用放大 100 倍的倒置相差顯微鏡根據細胞數量和形狀評估在培養基中培養的細胞的形態。
二、Vero 細胞懸浮培養
1.Vero 細胞在 250 mL 錐形瓶中在 5% CO 2條件置于二氧化碳振蕩培養箱中進行培養。貼壁細胞置于錐形瓶中，CO2搖床中，5% CO 2條件下，37℃培養5天；
2.使用血細胞計數器以及 0.4% 臺盼藍染色評估活細胞。
3.接下來，將粘附細胞以1.6×10 ⁵ 個細胞/m的密度添加到振蕩懸浮培養物中。連續培養懸浮培養中的活細胞，并通過臺盼藍染色監測其活力180天。
三、細胞轉染
Ad5  Adv包含在巨細胞病毒啟動子控制下的 GFP 基因。用Vero細胞進行Adv繁殖，然后用TCID 50滴定。為了比較粘附培養系統和懸浮培養系統之間的Adv產量，將兩種類型的 Vero 細胞接種（以 1.3×10 ⁶ 個細胞/mL 的密度）在培養皿或錐形瓶中并孵育 5 小時。然后以0.1的感染復數感染細胞5天。通過使用熒光酶標儀測量熒光強度來確定產生的 Ad5-GFP 的相對量并使用 GraphPad Prism ver.軟件進行統計分析。
四、統計分析
數據表示為平均值±平均值的標準誤差。使用 GraphPad Prism ver. 進行統計分析。所有 p 值均使用未配對的雙尾學生 t 檢驗 (α=0.05) 在 p<0.001 的顯著性水平上進行評估。
五、Vero細胞無血清懸浮培養技術驗證
為了研究Vero細胞是否可以在無血清條件下培養，對Vero細胞的形態變化和生長速率進行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir測試。在低血清培養條件下，在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或 VP-SFM 中培養的 Vero 細胞表現出與在常規培養基（含 10% FBS 的 DMEM）中培養的 Vero 細胞相似的形態（圖 1A ）). 然而，在 Ultraculture 或 Opti-MEM 中培養的 Vero 細胞表現出異常形態，例如細胞聚集，這在常規培養條件下是觀察不到的。當血清濃度從 10% 降低到 0% 時，OptiPRO 培養的 Vero 細胞在 0% FBS 的初始培養階段生長速率降低，但與常規培養條件（DMEM）相比，它們的生長速率增加并更高在 0% FBS 中培養 51 天后，含 10% FBS）（圖 1B）。然而，在 VP-SFM 或 SFM4MegaVir 培養基中培養的 Vero 細胞的生長速率低于在常規培養條件下培養的 Vero 細胞?？偟膩碚f，使用 OptiPRO 無血清培養基培養 Vero 細胞時不會發生形態變化和生長速率下降。


 
圖 1
(A) 在無血清條件下生長的 Vero 細胞形態。藍色和紅色箭頭代表異常的細胞生長。(B) 與在含有 10% FBS 的 DMEM 中培養的細胞（對照；藍線）相比，在無血清條件下培養的細胞的生長速率。DMEM，Dulbecco 改良的 Eagles 培養基；FBS，胎牛血清。




對照組實驗

我們測試了 Vero 細胞的無血清條件是否可以應用于另一種疫苗株生產細胞系 MRC-5 和對照細胞，即 FRhk-4 細胞。與在常規培養基（含有 10% FBS 的 MEM）中培養的細胞相比，在 SFM4MegaVir Opti-Pro 或 VP-SFM 中培養的所有 MRC-5 細胞均顯示出異常的細胞形態，例如細胞縮短（圖 2A ）。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或 Ultraculture 中培養的 FRhk-4 細胞未顯示任何異常形態（圖 2C）). MRC-5 細胞在 VP-SFM 或 OptiPRO 無血清培養基中的生長速率低于在常規培養基（含 10% FBS 的 MEM）中培養的細胞，但在 Opti-MEM 或 Ultraculture 培養基中則不然。然而，由于細胞形態的變化，在 Opti-MEM 或 Ultraculture 中培養的 MRC-5 細胞在 8% FBS 下無法持續減少（圖 2B）。在 VP-SFM 或 Opti-MEM 中培養的 FRhk-4 細胞顯示出與在常規培養基中培養期間相似的生長速率（圖 2D）。


總之，在沒有 FBS 的情況下，Vero 細胞的適宜培養條件可能不適用于其他疫苗株生產細胞，例如 MRC-5 細胞。
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